Praktikum 1:
Isolasi DNA/RNA dan Amplifikasi PCR

Bramadi Arya, S.Si., M.Biotech
Biologi Molekuler II · Pertemuan 7

Program Studi S1 Ilmu Biomedis
Universitas Syedza Saintika

Sasaran pertemuan

Pertemuan 7 · Isolasi asam nukleat dilanjutkan amplifikasi PCR

Sub-CPMK 9: menjelaskan dan mempraktikkan prinsip dasar preparasi asam nukleat dan PCR untuk aplikasi diagnostik dan riset.

Tujuan praktikum

  • Mengisolasi DNA atau RNA dari sampel biologis
  • Menilai kuantitas dan kualitas asam nukleat
  • Mengamplifikasi target dengan PCR
  • Memvisualisasikan hasil dengan elektroforesis gel

Prinsip isolasi asam nukleat

Empat tahap umum:

  1. Lisis sel: memecah membran dengan buffer, deterjen, dan sering proteinase K
  2. Pemisahan: menghilangkan protein dan kontaminan
  3. Pemurnian: kolom silika mengikat asam nukleat, kontaminan dicuci
  4. Elusi: asam nukleat dilepas dalam buffer bersih

Untuk RNA, semua alat harus bebas RNase karena RNA sangat mudah terdegradasi.

Menilai mutu hasil isolasi

  • Spektrofotometri: rasio A260/A280 sekitar 1,8 untuk DNA murni dan sekitar 2,0 untuk RNA
  • Konsentrasi: dibaca pada A260
  • Integritas: dicek dengan elektroforesis gel

Hasil isolasi yang baik menentukan keberhasilan tahap PCR.

Prinsip PCR

Tiga langkah berulang tiap siklus:

  1. Denaturasi (sekitar 95 derajat C): untai DNA memisah
  2. Annealing (sekitar 50 sampai 65 derajat C): primer menempel
  3. Ekstensi (sekitar 72 derajat C): polimerase menyalin untai

Komponen reaksi:

  • DNA cetakan
  • Sepasang primer
  • dNTP
  • DNA polimerase tahan panas (Taq)
  • Buffer dan ion magnesium

Perbaruan siklus dan amplifikasi

  • Setiap siklus melipatgandakan jumlah target
  • Umumnya 25 sampai 35 siklus
  • Untuk target RNA, lebih dahulu dibuat cDNA melalui reverse transcription (RT-PCR)

Elektroforesis gel

  • DNA bermuatan negatif, bergerak menuju kutub positif
  • Fragmen kecil bergerak lebih cepat, sehingga terpisah berdasarkan ukuran
  • Divisualisasi dengan pewarna dan sinar UV
  • Ukuran pita dibandingkan dengan marka ukuran (ladder)

Kontrol yang wajib ada

  • Kontrol negatif (tanpa cetakan): mendeteksi kontaminasi
  • Kontrol positif: memastikan reaksi berjalan
  • Marka ukuran: menilai ukuran produk

Tanpa kontrol, hasil positif atau negatif tidak dapat ditafsirkan dengan aman.

Keselamatan dan praktik baik

  • Kenakan jas lab dan sarung tangan
  • Pisahkan area pra-PCR dan pasca-PCR untuk mencegah kontaminasi silang
  • Tangani pewarna gel sesuai prosedur keselamatan
  • Catat setiap langkah pada lembar kerja praktikum

Laporan praktikum

Laporan minimal memuat:

  • Tujuan dan prinsip singkat
  • Alat, bahan, dan prosedur
  • Hasil: nilai konsentrasi, rasio kemurnian, foto gel
  • Pembahasan dan kesimpulan, termasuk analisis jika hasil tidak sesuai harapan

Rujukan metode: Sambrook dan Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; panduan praktikum program studi.

Terima kasih